Ecotoxicidade aguda, crônica e genotoxicidade de solo contaminado por óleo lubrificante usado e biorremediado para Eisenia andrei.

O objetivo do presente deste trabalho foi avaliar a toxicidade aguda, crônica e a genotoxicidade sobre E. andrei causadas por solo recém-contaminado com óleo lubrificante usado e após biorremediação por diferentes estratégias, após 22 meses, e paralelamente ao estudo de ecotoxicidade, foi conduzida uma investigação comparativa de três métodos de extração de HTP e HPA de solos para análise cromatográfica. A comparação das técnicas de extração evidenciou que para HTP, a técnica de extração acelerada por solvente-ASE foi a que melhor recuperou n-alcanos; já para as frações HRP e MCNR as técnicas soxhlet e micro-ondas-MARS não apresentaram diferenças significativas e foram melhores que ASE. Para HPA, a técnica de extração por soxhlet foi a que apresentou melhor recuperação em todos os solos. O teste de mortalidade apresentou, aos 14 dias, taxas crescentes de mortalidade de 10 6%, 20 0%, 73 25%, 93 12% e 100 0% para amostras de CONT (solo controle, sem contaminação artificial), BIOS (solo contaminado com 5% de OLU e biorremediado por bioestimulo), BIOA1 (solo contaminado com 5% de OLU e biorremediado por bioestimulo + bioaumento com adição de 10% de RSU maturado), e BIOA2 (solo contaminado com 5% de OLU e biorremediado por bioestimulo + bioaumento com adição de 10% de RSU semi-maturado) e OLU (solo contaminado com 5% de OLU), respectivamente. Aos 28 dias, entretanto, BIOS e OLU apresentaram taxas de mortalidade de 97 % 6 % e de 100 % 0 % respectivamente, valores estes significativamente superiores ao CONT. Foram observadas deformações anatômicas nos indivíduos mantidos em BIOS e OLU, assim como diminuição da biomassa em todas as amostras, evidenciando efeitos crônicos. O teste de reprodução, aos 28 dias, foram observadas grandes quantidades de indivíduos jovens nos solos biorremediados e recém-contaminado. No entanto, aos 56 dias houve uma diminuição dessas formas e o controle (CONT) exibiu uma quantidade maior de formas juvenis. O teste de densidade e viabilidade celular mostrou ser indicador sensível para toxicidade crônica apresentando queda nos solos BIOS e OLU em relação ao CONT com diferenças significativas (p <0.05). Não foram observados micronúcleos nos solos em estudo. Tal observação reforça a necessidade de testes de ecotoxicidade para avaliar a real eficácia de tecnologias de tratamento.

Ecotoxicidade aguda, crônica e genotoxicidade de solo contaminado por óleo lubrificante usado e biorremediado para Eisenia andrei.

O objetivo do presente deste trabalho foi avaliar a toxicidade aguda, crônica e a genotoxicidade sobre E. andrei causadas por solo recém-contaminado com óleo lubrificante usado e após biorremediação por diferentes estratégias, após 22 meses, e paralelamente ao estudo de ecotoxicidade, foi conduzida uma investigação comparativa de três métodos de extração de HTP e HPA de solos para análise cromatográfica. A comparação das técnicas de extração evidenciou que para HTP, a técnica de extração acelerada por solvente-ASE foi a que melhor recuperou n-alcanos; já para as frações HRP e MCNR as técnicas soxhlet e micro-ondas-MARS não apresentaram diferenças significativas e foram melhores que ASE. Para HPA, a técnica de extração por soxhlet foi a que apresentou melhor recuperação em todos os solos. O teste de mortalidade apresentou, aos 14 dias, taxas crescentes de mortalidade de 10 6%, 20 0%, 73 25%, 93 12% e 100 0% para amostras de CONT (solo controle, sem contaminação artificial), BIOS (solo contaminado com 5% de OLU e biorremediado por bioestimulo), BIOA1 (solo contaminado com 5% de OLU e biorremediado por bioestimulo + bioaumento com adição de 10% de RSU maturado), e BIOA2 (solo contaminado com 5% de OLU e biorremediado por bioestimulo + bioaumento com adição de 10% de RSU semi-maturado) e OLU (solo contaminado com 5% de OLU), respectivamente. Aos 28 dias, entretanto, BIOS e OLU apresentaram taxas de mortalidade de 97 % 6 % e de 100 % 0 % respectivamente, valores estes significativamente superiores ao CONT. Foram observadas deformações anatômicas nos indivíduos mantidos em BIOS e OLU, assim como diminuição da biomassa em todas as amostras, evidenciando efeitos crônicos. O teste de reprodução, aos 28 dias, foram observadas grandes quantidades de indivíduos jovens nos solos biorremediados e recém-contaminado. No entanto, aos 56 dias houve uma diminuição dessas formas e o controle (CONT) exibiu uma quantidade maior de formas juvenis. O teste de densidade e viabilidade celular mostrou ser indicador sensível para toxicidade crônica apresentando queda nos solos BIOS e OLU em relação ao CONT com diferenças significativas (p <0.05). Não foram observados micronúcleos nos solos em estudo. Tal observação reforça a necessidade de testes de ecotoxicidade para avaliar a real eficácia de tecnologias de tratamento.

Ocorrência e ecotoxicidade de desreguladores endócrinos químicos em ambientes aquáticos e em sistemas de tratamento de esgoto

A aplicabilidade de um método selecionado de medição indireta de vitelogenina (Vtg) em plasma sanguíneo de peixe, baseado na quantificação de fosfato álcali-lábil (alkali-labile phosphate-ALP) para acessar estrogenicidade em água, foi investigada na presente tese. O método foi originalmente desenvolvido para a espécie de peixe Carassius carassius (Carpa cruciana) e aplicado pela primeira vez na espécie Oreochromis niloticus (Tilápia do Nilo) no presente estudo. Com o objetivo de acessar a sensibilidade do método, em uma primeira etapa da investigação foram realizados estudos laboratoriais com soluções estoques de 17-ethinylestradiol (EE2), 17-estradiol (E2), e estrona (E1). Os efeitos destes hormônios foram investigados com base tanto na concentração quanto na carga, utilizando-se para tanto, unidades experimentais com volumes distintos (2 L e 130 L). Após a validação do método de ALP, a estrogenicidade foi avaliada nas seguintes águas contaminadas: (i) afluente e efluente de uma grande estação de tratamento de esgotos convencional (ETE) e de uma estação descentralizada de tratamento de esgoto de pequeno porte (Ecossistema Engenheirado-DEE); (ii) água superficial (SW) e água subterrânea (GW) coletadas em uma área de brejo contaminada com gasolina; (iii) água de uma lagoa urbana (LRF) da cidade do Rio de Janeiro, com alta densidade populacional e descarte clandestino de esgoto. Na segunda etapa foram analisados em microalgas os efeitos (outros que não disrupção endócrina) causados pelos hormônios EE2, E2 e E1. Os hormônios foram testados individualmente e em misturas, em culturas individuais e combinada (S+) das espécies de microalgas unicelulares P. subcapitata e D. subspicatus. Com base nos níveis de ALP para a espécie de peixe e no EC50 para as espécies de algas, os resultados mostraram que o EE2 e o E2 causaram disrupção endócrina superior e foram mais tóxicos do que o E1 para peixes e microalgas respectivamente. Quando em misturas (E+) de concentrações equivalentes (EE2:E2:E1), os estrogênios resultaram em efeito aditivo para as espécies O. niloticus e P. subcapitata, e menos que aditivo para D. subspicatus e cultivo misto de algas (S+). Culturas contendo ambas as espécies de algas (S+) por um longo período de exposição (96 h) resultaram na atenuação dos efeitos tóxicos causados pela exposição, tanto individual (EE2, E2 ou E1), quanto na mistura (E+) dos estrogênios, medidos em termos de EC50 (T0h 0,07; 0,09; 0,18; e 0,06 g mL-1; e T96h 1,29; 1,87; 5,58; e 4,61 g mL-1, respectivamente). O DEE apresentou uma maior eficiência na remoção dos disrutores endócrinos do que a ETE convencional. Foi detectada estrogenicidade em amostras da LRF, e de água SW e GW em área brejosa contaminada com gasolina. Os resultados dos ensaios sugerem que as interações (efeitos aditivos ou menos que aditivo) causadas pela mistura dos estrogênios assim como, as interações entre as espécies de algas afetaram o resultado final dos ensaios ecotoxicológicos. Um fator raramente abordado em estudos ecotoxicológicos que foi destacado na presente tese refere-se à importância de considerar não somente a concentração e a dosagem, mas também a carga aplicada e o volume das unidades experimentais. Devido à boa sensibilidade do O. niloticus quando exposto às concentrações relativamente baixas dos estrogênios, a combinação do método de ALP com os biomarcadores auxiliares (particularmente MN) pode ser um protocolo adequado para a detecção de estogenicidade e genotoxicidade respectivamente em diferentes ambiente aquáticos contaminados, como parte de um programa de monitoramento ambiental

Estudo da contaminação e da toxicidade do solo do Aterro Metropolitano de Gramacho, Duque de Caxias RJ.

O Aterro Metropolitano de Gramacho, considerado o maior da América Latina, teve encerradas as suas atividades de disposição de resíduos em meados de 2012. A disposição de resíduos no local foi realizada diretamente sobre o solo de fundação desde o início de sua operação (1978). Considerando-se que os contaminantes presentes no lixiviado podem migrar por difusão através da argila organo-salina do aterro e atingir o entorno, foi feita uma investigação da contaminação do solo no perímetro do aterro. Essa investigação foi realizada no líquido intersticial do solo e foi pautada em dois tipos de contaminantes: nitrogênio amoniacal e compostos orgânicos, medidos pelo parâmetro carbono orgânico total (COT). Além disso, foram também realizados ensaios de toxicidade aguda com a espécie Vibrio fischeri para avaliar a toxicidade no solo. Ensaios de sorção e difusão foram executados a fim de melhor compreender o comportamento dos contaminantes investigados. Os resultados apontaram baixos valores de nitrogênio amoniacal e de COT no solo. Os valores de nitrogênio amoniacal são considerados baixos, pois mesmo em amostras de solo da barreira lateral, que é situada próxima à antiga vala de drenagem de lixiviado, estes são menores que 1% do encontrado no lixiviado, indicando a adsorção do solo. Os ensaios de toxicidade aguda apontaram o efeito Hormesis nas amostras de líquido intersticial, indicando a possibilidade de presença de toxicidade crônica.

Avaliação de toxicidade de efluentes industriais utilizando organismos de três níveis tróficos.

O objetivo do estudo foi avaliar a qualidade de efluentes líquidos industriais, pela caracterização físico-química e ensaios ecotoxicológicos agudos com Danio rerio, Daphnia similis e Vibrio fischeri. Foram comparadas as sensibilidades dos organismos-teste aos variados tipos de efluentes (indústrias alimentícias, papeleiras, bebidas, petroquímicas e farmacêutica), sendo que estes organismos pertencem a três níveis tróficos diferentes. Além disso, foi implementado o método de ensaio com bactérias luminescentes, o Microtox, de acordo com a NBR 15411 (ABNT, 2006). Na maioria dos ensaios, os efluentes apresentaram parâmetros físico-químicos dentro dos limites permitidos pela legislação. Mesmo assim, algumas vezes foram observados efeitos nos organismos-teste. Foram utilizados efluentes tratados das ETEI, podendo ser avaliada a sensibilidade de cada organismo a cada efluente do estudo. Para a Indústria Alimentícia 1 foram realizadas coletas de efluente bruto e primário, que se mostraram tóxicos aos três organismos. Essa coleta também foi realizada para a Indústria Farmacêutica, na qual o efluente bruto foi tóxico aos três organismos e o efluente do tratamento primário, foi tóxico à Daphnia similis e à Vibrio fischeri. O efluente bruto da Indústria Alimentícia 2, da Indústria de Papel e Celulose 2 e da Indústria de Bebidas foram coletados e avaliados ecotoxicologicamente por meio do ensaio Microtox, demonstrando toxicidade aguda com baixos valores de CE(I)50 para todas as indústrias. Alguns parâmetros físicoquímicos das indústrias foram correlacionados com a toxicidade do efluente final para Daphnia similis, Danio rerio e Vibrio fischeri por meio da correlação de Spearman. O teste não paramétrico Mann-Whitney foi usado para comparar grupos de parâmetros físico-químicos que apresentaram presença ou ausência de toxicidade. Em alguns efluentes tratados das ETEI das Indústrias Alimentícia 1, Alimentícia 2, de Papel e Celulose 2 e Petroquímica 1, foram observadas respostas biológicas das bactérias aos efluentes, o efeito hormesis, que indica que a amostra não possui toxicidade aguda, mas é muito provável que apresente toxicidade crônica.

Avaliação química e ecotoxicológica para seleção de bioensaios aquáticos sensíveis a efluentes contendo metais

A Resolução CONAMA N 430/2011 exige a utilização de dois bioensaios (dois níveis tróficos) para avaliação ecotoxicológica de efluentes, mas a seleção ao acaso de bioensaios pode permitir lançamentos tóxicos. A sensibilidade dos bioindicadores irá depender da substância tóxica avaliada. Assim, baterias de bioensaios sensíveis devem ser estabelecidas às classes de contaminantes. Na literatura não há estudos que indiquem uma bateria de bioensaios ecotoxicológicos sensíveis para avaliação de efluentes contendo principalmente metais. Esse trabalho teve como objetivo selecionar uma bateria de bioensaios ecotoxicológicos que conjuntamente detectem toxicidade ao maior número de metais isolados e em misturas e que sejam realizados no menor tempo indicado pelas normas de padronização. Foram avaliadas as sensibilidades de seis bioensaios, incluindo três níveis tróficos (produtores, algas: Pseudokirchneriella subcapitata e Chlorella vulgaris; consumidores primários, cladóceros: Daphnia similis e Ceriodaphnia dubia; consumidores secundários, peixes: Poecilia reticulata e Danio rerio), a 10 espécies metálicas individuais (Ag+, Cd2+, Cu+, Cu2+, Cr3+, Cr6+, Pb2+, Ni2+, Zn2+ e Hg2+) e a efluentes reais (siderúrgicos) e simulados em laboratoriais (baseado nos limites máximos permitidos para descarte). Os bioensaios com peixes foram os menos sensíveis, D. rerio não detectou toxicidade em nenhum dos efluentes testados. P. subcapitata foi um bom bioindicador de toxicidade de Cr3+ e D. similis foi o organismo mais sensível a Hg2+. O uso combinado do bioensaio crônico de 72h com C. vulgaris e do bioensaio agudo de 48h com C. dubia garantiu a detecção das menores concentrações dos metais tanto individualmente quanto em efluentes reais e simulados. Apesar de P. subcapitata ser um bom bioindicador da toxicidade de Cr3+, a interação dos metais em misturas tornou C. vulgaris igualmente sensível. Da mesma forma, apesar de D. similis ter sido mais sensível ao Hg2+, o efeito da toxicidade dos efluentes com maiores teores de Hg2+ foi detectado por C. dubia

Construção, clonagem e expressão do fragmento B da toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae (cepa PW- 8) em Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau

A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo.